Ligationskalkylator
Kategori: BiologiVektor DNA
Insert DNA
Ligation Reaktionsinställning
Komplett Reaktionsinställning
| Komponent | Volym (μL) | Slutlig Mängd |
|---|---|---|
| Vektor DNA (50 ng/μL) | 1.0 | 50 ng |
| Insert DNA (25 ng/μL) | 0.33 | 8.3 ng |
| 10× T4 DNA Ligase Buffert | 2.0 | 1× |
| T4 DNA Ligase | 1.0 | 400 U |
| Nukleasfri Vatten | 15.67 | Till 20 μL |
| Total Volym | 20.0 |
Optimeringstips
Baserat på dina inmatningsparametrar, här är några rekommendationer:
- För 5' klibbiga ändar med ett vektor:insert förhållande av 1:3, inkubera vid 16°C i 4 timmar.
- CIP-behandling av vektorn kommer att hjälpa till att minska själv-ligation bakgrund.
- Om transformations effektiviteten är låg, försök att öka insert:vektor förhållandet till 5:1.
- För trubbiga ändligeringar, öka ligase koncentrationen och förläng ligationstiden.
- Värmeinaktivera ligasen vid 65°C i 10 minuter före transformation för bästa resultat.
Om DNA Ligation
- DNA-ligation involverar sammanfogning av DNA-fragment genom bildandet av fosfodiesterbindningar.
- T4 DNA-ligase kräver ATP och Mg²⁺ för att fungera korrekt (tillhandahålls i ligationsbufferten).
- Klibbiga ändligeringar är mer effektiva än trubbiga ändligeringar.
- Vektor:insert molar förhållanden ligger vanligtvis mellan 1:3 till 1:5 för standard kloning.
- Högre insert:vektor förhållanden (3:1 till 10:1) rekommenderas för trubbiga ändligeringar eller större inserts.
- Dephosphorylering av vektorer (använder CIP, SAP, etc.) förhindrar vektor själv-ligation.
- Snabb ligase-system kan minska ligationstiden till 5-15 minuter vid rumstemperatur.
Formel för insättningsmängd (ng):
\[ \text{Insert ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Insert size in kb}}{\text{Vector size in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Insert moles}}{\text{Vector moles}} \right) \]
Vad är Ligation Calculator?
Ligation Calculator är ett verktyg som hjälper forskare att bestämma rätt mängd vektor- och insättnings-DNA som krävs för en lyckad ligationsreaktion. DNA-ligation är ett kritiskt steg inom molekylär kloning, där ett DNA-inlägg kopplas till en plasmidvektor med hjälp av ett enzym som kallas DNA-ligas.
Hur fungerar det?
Denna kalkylator låter användare mata in detaljer om sin vektor och sitt inlägg, inklusive längd och koncentration. Baserat på det valda molära förhållandet beräknar den den nödvändiga mängden insättnings-DNA för att uppnå en optimal ligationsreaktion.
Huvudfunktioner
- Beräknar molära förhållanden mellan vektor och inlägg för olika kloningsscenarier.
- Stöder både standard- och anpassade molära förhållanden.
- Ger rekommendationer för ligationsförhållanden baserat på sticky- eller blunt-end-kloning.
- Inkluderar optimeringstips för att förbättra ligationseffektiviteten.
Hur man använder kalkylatorn
- Ange vektorlängd (bp) och koncentration (ng/μL).
- Ange insättningslängd (bp) och koncentration (ng/μL).
- Välj önskat molärt förhållande mellan vektor och inlägg (t.ex. 1:3, 1:5).
- Ange den totala reaktionsvolymen (t.ex. 20 μL).
- För avancerade inställningar, välj ligationstemperatur, varaktighet, ligastyp och vektorbehandlingsalternativ.
- Klicka på "Beräkna" för att generera den rekommenderade insättningsmängden och reaktionsinställningen.
Vanliga frågor
Vad är det optimala molära förhållandet mellan vektor och inlägg?
För sticky-end-ligationer rekommenderas generellt ett 1:3- eller 1:5-förhållande mellan vektor och inlägg. För blunt-end-ligationer kan ett högre förhållande (t.ex. 1:5 till 1:10) förbättra effektiviteten.
Varför rekommenderas vektordefosforylering?
Defosforylering (med hjälp av CIP, SAP eller Antarctic Phosphatase) förhindrar själv-ligation av vektorn, vilket minskar oönskade bakgrundskolonier.
Vilka ligationsförhållanden bör jag använda?
- 16°C i 4 timmar – Standardförhållande för T4 DNA-ligas.
- Rumstemperatur i 15 minuter – Lämpligt för Quick Ligase.
- Över natten vid 16°C – Rekommenderas för utmanande ligationer eller blunt-end-kloning.
Hur kan jag förbättra ligationseffektiviteten?
- Säkerställ korrekt molärt förhållande mellan vektor och inlägg.
- Använd färskt DNA-ligas och buffert.
- Optimera ligationsförhållanden (temperatur och varaktighet).
- Bekräfta inläggs närvaro via gelelektrofores före ligation.
Varför använda denna kalkylator?
Denna Ligation Calculator förenklar inställningen av DNA-ligationsreaktioner och hjälper forskare att bestämma rätt mängder vektor och inlägg för effektiv kloning. Genom att automatisera beräkningar och erbjuda optimeringstips sparar den tid och ökar framgångsgraden för ligationsexperiment.